Το επόμενο βήμα προς την εξωσωματική γονιμοποίηση είναι η αναρρόφηση του ωοθυλακικού υγρού και των ωαρίων από τα ωοθυλάκια της γυναίκας, δηλαδή η ωοληψία. Η διαδικασία αυτή γίνεται με διακολπική παρακέντηση με τη βοήθεια υπερήχου, είναι σύντομη και σχετικά ανώδυνη. Χορηγείται ελαφριά μέθη από αναισθησιολόγο. Στην περίπτωση αναρρόφησης ενός ή λίγων ωαρίων (2-3) η γυναίκα μπορεί να αποφύγει τη μέθη αν το επιθυμεί. Το ωοθυλακικό υγρό εξετάζεται από τους εμβρυολόγους για την ανεύρεση των ωαρίων, τα οποία συλλέγονται και φυλάσσονται μέσα σε καλλιεργητικό υγρό σε επωαστικούς κλιβάνους μέχρι το επόμενο βήμα, δηλαδή αυτό της γονιμοποίησης.
Λίγο μετά την ολοκλήρωση της ωοληψίας ο σύζυγος δίνει σπέρμα για να πραγματοποιηθεί η γονιμοποίηση. Εναλλακτικά, κατόπιν συννενόησης με τον ιατρό και τον εμβρυολόγο, μπορεί να χρησιμοποιηθεί καταψυγμένο σπέρμα όταν αυτό υπάρχει.Σημαντικό είναι η κατάψυξη του σπέρματος να έχει πραγματοποιηθεί πριν την ημέρα της ωοληψίας. Το δείγμα, είτε φρέσκο είτε καταψυγμένο, υπόκειται ειδική επεξεργασία, καθαρίζεται και εμπλουτίζονται τα καλώς κινούμενα σπερματοζωάρια.
Σε περίπτωση ανυπαρξίας σπερματοζωαρίων στο σπέρμα, εξωσωματική γονιμοποίηση μπορεί να πραγματοποιηθεί με σπερματοζωάρια που λαμβάνονται από βιοψία όρχεων ή από την επιδιδυμίδα (μέρος του ανδρικού αναπαραγωγικού συστήματος) μέσω μικροχειρουργίου στον άνδρα.
Τέλος, γυναίκες των οποίων ο σύζυγος πάσχει από ολική αζωοσπερμία (ανυπαρξία σπερματοζωαρίων) ή γυναίκες δίχως σύντροφο, μπορούν να προχωρήσουν σε εξωσωματική γονιμοποίηση και να γονιμοποιήσουν τα ωάρια τους με σπέρμα τρίτου ανώνυμου δότη, από τράπεζα σπέρματος.
